Codice insegnamento

4S008292

Docente

Salvatore Fusco

Coordinatore

Salvatore Fusco

Crediti

6

Lingua di erogazione

Italiano

Settore Scientifico Disciplinare (SSD)

BIO/10 - BIOCHIMICA

Periodo

II semestre dal 1 mar 2021 al 11 giu 2021.

Orario Lezioni Moodle Seminari 0

Obiettivi formativi

Il corso si propone di fornire allo studente le conoscenze di base e avanzate della biocatalisi applicata in ambito industriale, terapeutico e diagnostico. In particolare, gli obiettivi principali del corso riguardano la comprensione: 1) dei principi alla base della catalisi enzimatica; 2) delle nuove frontiere applicative degli enzimi; 3) delle metodiche molecolari per ottimizzare la reattività degli enzimi e 4) degli approcci innovativi per lo sviluppo di enzimi artificiali che mostrano reattività non naturali.

Programma

Il programma dettagliato del corso è attualmente in via di definizione. Gli argomenti di seguito riportati sono solo indicativi dei contenuti didattici del corso e possono essere soggetti a modifiche da parte del docente:

1. Introduzione e contesto: Concetto di biorisorsa; Concetto di sostenibilità; Vantaggi dei catalizzatori biologici; Storia della catalisi e caratteristiche principali degli enzimi; Catalisi enzimatica; Specificità enzimatica; Nomenclatura degli enzimi; Isoenzimi, sistemi multienzimatici e complessi multienzimatici.

2. Principi e aspetti pratici della cinetica enzimatica: Catalisi enzimatica; Principi di cinetica delle reazioni chimiche; Principi di cinetica delle reazioni enzimatiche; Equazione di Michaelis e Menten; Significato e interpretazione delle costanti cinetiche; Come studiare l'attività enzimatica e determinare le costanti cinetiche; Aspetti pratici dei saggi enzimatici per la determinazione delle costanti cinetiche; Influenza del "dead time", saggi continui e discontinui; Metodi di linearizzazione dell'equazione di Michaelis-Menten; Metodi di ottimizzazione non lineare; Utilità dei metodi di ottimizzazione lineare; Determinazione della V0 e delle Unità enzimatiche: esempi pratici; Saggi enzimatici diretti e indiretti: esempi, pro e contro; Come procedere per la messa a punto di saggi enzimatici diretti e indiretti.

3. Ingegneria proteica:
3.1 Modificazioni chimiche: Principi e definizioni; Modificatori chimici e inibitori irreversibili; Marcatori di affinità, substrati suicidi e analoghi dello stato di transizione; Modifiche chimiche non specifiche: casi studio (EDCA, NHS, anidridi acide); Modifiche chimiche specifiche: Atom Replacement and Segment Reassembly; Modificatori della specificità delle protesi a serina e delle nucleasi; Legame covalente di cofattori.

3.2 Rational Design: Introduzione ai vari metodi di modifica sito-diretta; Sequence Overlap Extension (SOE) or Fusion PCR; -Combined Chain Reaction (CCR); MegaPrimer PCR amplification (case studies); Whole plasmid PCR; Cassette mutagenesis (Gibson assembly); The Kunkel method; Megaprimer whole-plasmid PCR; QuikChange mutagenesis; Site-directed mutagenesis by recombineering; Single Oligonucleotide Mutagenesis and Cloning Approach (SOMA); UnRestricted Mutagenesis and Cloning (URMAC); LFEAP mutagenesis (case studies); Site-saturation mutagenesis: concetti ed applicazioni.

3.3 Directed Evolution: Rational Design versus Directed Evolution; The Paradigm Shift; Evolution and Probability; Randomly Mutated Plasmid Libraries Using Mutator Strains; Error-Prone PCR (The Bias Problem, Some Considerations and Case Studies); SeSaM Method; RID Mutagenesis; MAX randomization; MEGAWHOP; Gene Assembly Mutagenesis; Random Oligonucleotide Mutagenesis; Recombination methods: DNA Shuffling, Family Shuffling with Single-Stranded DNA, DNA Recombination by Random Priming (RPR), StEP, RDA-PCR, RACHITT, ITCHY, SHIPREC; Laboratory neutral drift.

3.4 Selection and Screening: The Importance of the Right Screening System; Enzimi specialisti e generalisti; Screening vs Selection; In vivo and In vitro Selection Systems: phage diplay; Screening: Agar Plate, Microtiter Plate (Pooling), Cells in Droplets, Cells as Micro-Reactors, Cell Surface Display and in vitro compartmentalization.

3.5 Semi-Rational Design: Selection of the Preferred Experimental Approach; Identification of Functional Sites by Evolutionary Tracing; SCOPE; CAST, Method and Iterative CASTing; ISM Method; SCHEMA; Development of enzymes for industrial applications.

3.6 Protein Engineering for Enzyme Optimization: Case Studies; CoFi Blot and Hot-CoFi; Sequence-based engineering: MSA, CA and ASR; Structure-based engineering: Beta-factor analysis, MDS, FoldX and Rosetta_ddg;

4. New Frontiers in PhotoBioCatalysis (Dr David Cannella): Historical aspects: Biocatalysis and Artificial photosynthesis; PhotoBioCatalysis; Light and Photosensitizers; Sacrificial reductants; Enzymes: LPMOs, Laccases, AeUPOs, CHMO, cvFAP; Substrates and Application; Open discussion with the guest speaker.

5. Enzymes in non-conventional media: Principi della chimica verde; Uso degli enzimi nella sintesi organica (SWOT analysis); Principi di "medium engineering"; Vantaggi e svantaggi dell'utilizzo di solventi organici nella biocatalisi; L'importanza dell'acqua nell'applicazione dei mezzi non convenzionali per la biocatalisi; Memoria molecolare: come preparare gli enzimi per reazioni in solventi organici.

5.1 Solventi organici: Sistemi a due fasi, sistemi di co-solventi e catalisi in solventi anidri; The Role of Solvent Properties: log P Concept, Solvent Polarity and Hydrophobicity; Case Studies: "Methanolysis of Triacylglycerols for Biodiesel Production" and "Synthesis of Fructose Laurate Esters".

5.2 Liquidi ionici: generalità, proprietà e applicazioni; Comparazione dei liquidi ionici con i solventi organici; Stabilità degli enzimi nei liquidi ionici; Strategie biocatalitiche nei liquidi ionici; Strategies for enzyme-catalysed reactions in ILs: Monophasic IL systems; Supported Liquid Membrane (SLM); Waste-free process using a double pervaporation system.

5.3 Supercritical Fluids (SCF); Phase Diagrams: Triple Points, Critical Points and Supercritical Fluids; Supercritical Fluids (SCF): Supercritical Carbon Dioxide (scCO2); -Supercritical Fluids (SCF): Reactor Design; Case Studies:Sugar fatty acid ester synthesis in high-pressure acetone–CO2 system; Multiphase biocatalytic systems based on ILs and scCO2.

6. Computational and structure-inspired enzyme engineering (Prof. Marco Fraaije): Long history in (bio)chemistry; Research focus and Expertise of the Molecular Enzymology group; Focus on flavin-dependent enzymes; Flavoenzymes: chemically versatile; Discovery of alditol oxidase (AldO); Molecular dynamic simulations; The oxidase-dehydrogenase switch; Pathway of HMF oxidation by HMFO; FRESCO: Framework for Enzyme Stabilization by Computation; Open discussion with the guest speaker.

7. Catalisi enzimatica omogenea ed eterogena (immobilizzazione):
7.1 Catalisi enzimatica omogenea: Aree di applicazione della catalisi omogenea; Sistemi multienzimatici (cascate enzimatiche lineari, parallele, ortogonali e cicliche); Esempi pratici di cascate enzimatiche (produzione di composti chimici profumati, amminoacidi non naturali, precursori plastici, pirrolidina di-sostituite, derivati della D-fenilalanina);

7.2 Catalisi eterogena (immobilizzazione degli enzimi); Vantaggi e svantaggi dell’immobilizzazione; Supporti per l’immobilizzazione; Strategie d’immobilizzazione (covalente, adsorbimento, intrappolamento e incapsulamento); Immobilizzazione senza supporto (CLECs and CLEAs); Nuove frontiere dell’immobilizzazione enzimatica: supporti virali e nanoreattori.

8. CO2 capture and utilization: new frontiers in biocatalysis_Dr. Annabel Serpico: Transforming raw CO2 waste into value-added chemicals and plastics (Why? How? What for?); Carbon capture and utilisation (CCU); CO2 as building block; Biological CCU: Microalgal and Bacterial CUU; Biocatalytic CO2 conversion: Enzymatic conversion of CO2 to methanol; Current challenges of using CO2 in biotechnology; The carbonic anhydrase enzyme (CA): CO2 solubilisation improvement using hCAII; Open discussion with the guest speaker.

9. Il sistema CRISPR-Cas principi e applicazioni: CRISPR locus e geni cas; Meccanismo di funzionamento del sistema CRISPR-Cas; I tre tipi principali di sistemi CRISPR/Cas; Approfondimenti sul sistema CRISPR/Cas9; Applicazione del sistema CRISPR/Cas9 per il genome editing e l’ingegneria proteica; Varianti dell’endonucleasi Cas9 e loro applicazioni; il sistema CRISPR/Cas9 come strumento di screening di library di mutanti generate mediante directed evolution.

Materiale didattico:
-Diapositive del corso (fornite al termine di ogni lezione)
-Articoli scientifici (referenze citate durante le lezioni)

Modalità d'esame

L'esame finale mira a verificare il raggiungimento degli "Obiettivi formativi" relativi agli argomenti riportati nel "Programma dell’insegnamento".
La modalità di verifica dell’apprendimento prevede una prova orale volta ad accertare sia l’acquisizione delle conoscenze definite nel programma d'insegnamento sia la capacità di eseguire i necessari collegamenti logico-deduttivi. In particolare, il grado di completezza della risposta, il livello di integrazione tra i vari contenuti del corso e l'appropriatezza scientifica del linguaggio saranno tutti elementi oggetto di valutazione.
Inoltre, il raggiungimento da parte del/della candidato/a di una visione organica dei temi affrontati a lezione, congiunta alla loro utilizzazione critica, la capacità di fare collegamenti, la dimostrazione del possesso di una padronanza espositiva e di linguaggio specifico saranno valutati con voti di eccellenza.
La modalità d'esame è la stessa sia per i candidati frequentanti sia non frequentanti.