L'insegnamento è organizzato come segue:

Obiettivi formativi

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MM: METODI E TECNICHE DI GENETICA E BIOLOGIA MOLECOLARE
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Acquisire conoscenza teorica delle principali metodiche di biologia molecolare di base. Discussione critica di protocolli selezionati applicati alle metodologie diagnostiche del laboratorio di biologia molecolare per acquisire familiarità propedeutica all’applicazione pratica di tali protocolli.
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MM: BIOTECNOLOGIE RICOMBINANTI
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Il corso si propone di esercitare lo studente alla discussione degli aspetti critici nella esecuzione di protocolli di analisi molecolare; familiarizzare lo studente con le moderne tecniche di analisi genomica e le applicazioni in campo biomedico delle biotecnologie ricombinanti.
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MM: BIOLOGIA MOLECOLARE
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Conoscenza delle applicazioni della biologia molecolare clinica alla diagnostica di laboratorio in: genetica oncoematologia delle malattie mieloproliferative croniche e delle leucemie acute, genetica del ritardo mentale, infertilità di coppia, malattie mendeliane (Fibrosi Cistica ed Emocromatosi), diagnostica prenatale, farmacogenetica
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MM: BIOCHIMICA E CHIMICA DELL'INQUINAMENTO AMBIENTALE
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Fornire le nozioni necessarie per “capire” l’inquinamento biochimico e chimico e inquadrare le tecniche analitiche appropriate per rilevarlo.
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MM: METODOLOGIA DIAGNOSTICA MOLECOLARE
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Scopo del corso è di introdurre gli studenti ai principi ed alle tecnologie di base ed avanzate della biologia molecolare clinica, di illustrarne le modalità di applicazione nella diagnosi, nella predizione, nella prognosi e nel supporto terapeutico delle principali patologie umane.

Programma

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MM: METODI E TECNICHE DI GENETICA E BIOLOGIA MOLECOLARE
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Acidi nucleici: composizione e proprietà di DNA ed RNA. Tecniche di conservazione di diverse tipologie di materiale per l’estrazione di DNA con particolare riguardo per sangue, fluidi biologici, tessuto congelato e tessuto fissato incluso in paraffina. Principi e caratteristiche delle principali tecniche di estrazione del DNA. Descrizione ed esame in particolare dei protocolli per l’estrazione di DNA mediante fenolo/cloroformio (simulazione), TRIzol, kit commerciali con resine su colonna e con biglie mangnetiche (simulazione). Tecniche di microdissezione manuale e laser assistita di tessuti inclusi in paraffina. Tecniche di conservazione di diverse tipologie di materiale per l’estrazione di RNA con particolare riguardo per sangue, fluidi biologici, tessuto congelato. Problematiche legate alle RNasi: come gestirle in laboratorio. Principi e caratteristiche delle principali tecniche di estrazione dell’RNA. Descrizione ed esame in particolare dei protocolli per l’estrazione di RNA mediante gradiente di Cloruro di Cesio, TRIzol, kit commerciali. Richiamo alle tecniche di centrifugazione con riferimento particolare all’ultracentrifuga. Controllo qualitativo e quantitativo del DNA estratto mediante tecniche spettrofotometriche (spettrofotometro classico e Nanodrop), fluorimetriche (Qubit) e separazione elettroforetica. Principi alla base di tali tecniche e protocolli. Elettroforesi. Gel di agarosio come setacci per le molecole, marcatori di peso molecolare, sistemi di rilevazione del DNA dopo elettroforesi (simulazione). Controllo qualitativo e quantitativo dell’RNA estratto mediante tecniche spettrofotometriche (spettrofotometro classico e Nanodrop), fluorimetriche (Qubit) ed elettroforesi in sistemi capillari (bioanalyzer Agilent) . Principi alla base di tali tecniche e protocolli. Tecniche di Ibridazione degli acidi nucleici. Southern blot, Northern blot. Caratteristiche delle sonde: lunghezza, temperatura di “melting”, metodi di rivelazione (radioattivi, enzimatici). Applicazioni pratiche nella routine diagnostica con particolare riferimento ai protocolli per l’ibridazione inversa (su striscia di carta) e l’ibridazione in fase liquida. Reazione di polimerizzazione a catena (PCR). Primers, nucleotidi, Taq DNA polimerasi, Tamponi. Software per il disegno dei primers. Allestimento di un protocollo tipo (simulazione). I termociclatori: allestimento di un programma tipo (simulazione). Problematiche legate alla contaminazione. Visualizzazione del prodotto di PCR. Descrizione ed esame di un protocollo diagnostico specifico. Sequenziamento: Sanger, principio del metodo. Esempio di protocollo applicato alla routine diagnostica per l’analisi mutazionale del gene KRAS nelle neoplasie solide. Materiale di partenza, microdissezione, allestimento reazione PCR, controllo amplificato su Agilent bioanalyzer, purificazione con biglie, allestimento reazione di sequenza, purificazione con biglie, corsa su sequenziatore (AB 3130XL), verifica dell’elettroferogramma. Cenni ai metodi di sequenziamento alternativi al Sanger.
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MM: BIOTECNOLOGIE RICOMBINANTI
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• Analisi del DNA mediante enzimi di restrizione e modificazione, polimerizzazione a catena, ibridazione con sonde molecolari; utilizzo di genoteche e cDNAteche. • Determinazione delle sequenze degli acidi nucleici, sequenziamento automatico; interpretazione dei dati di sequenza. Applicazioni in campo biomedico delle analisi di sequenza. • Utilizzo di banche dati e di sistemi di analisi per omologia: come orientarsi nella rete informatica per l'accesso ai siti di aggiornamento ed analisi delle sequenze geniche. • Strategie di clonazione di geni ed analisi dell’espressione genica. • Applicazioni in campo biomedico delle tecnologie del DNA ricombinante. • Tecniche applicate all’analisi genomica, trascrittomica e proteomica.
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MM: BIOLOGIA MOLECOLARE
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Il Corso si propone di far comprendere allo studente il ruolo dei test genetici nel percorso clinico del paziente e di fornire una visione aggiornata delle metodiche di biologia molecolare che trovano applicazione in ambito clinico. Tutte le lezioni, tranne la prima introduttiva, saranno suddivise in una prima parte in cui verrà trattata la patologia o la problematica clinica, ed una seconda in cui verrà trattato l’approccio diagnostico di laboratorio (esami di primo, secondo e terzo livello). Nel corso delle lezioni saranno discusse anche le problematiche relative all’appropriatezza delle richieste, alla raccolta del campione biologico idoneo e alla scelta della metodica analitica adeguata al quesito ed al contesto clinico.
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MM: BIOCHIMICA E CHIMICA DELL'INQUINAMENTO AMBIENTALE
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Definizioni; tipi di inquinamento; Agenti causali di inquinamento; Metodi di analisi dell’inquinamento chimico; Tipi di danno alla salute; Effetti diretti e indiretti dell’inquinamento; Costi dell’inquinamento; Tecniche di riduzione dell’inquinamento; Inquinamento dell’aria; Inquinamento dell’acqua; Inquinamento del suolo. BIOCHIMICA E CHIMICA DELL’INQUINAMENTO AMBIENTALE Definizione di Ambiente. - Definizione di Inquinamento. - Tipi di Inquinamento: Chimico-Biochimico; Microbiologico; Parassitologico; Radioattivo; Acustico; Luminoso; Termico; da Polveri; da Fumi; da Energie; altri. - Agenti causali di inquinamento chimico (interno ed esterno). - Metodi di analisi dell’inquinamento chimico: Chimici; Elettrochimici; Cromatografici; Immunometrici; Spettrometrici di massa; Spettrometrici in assorbimento atomico; Microscopici diretti; RMN; PET; Metodi biologici. - Tipi di danno alla salute: Carcinogenesi, Mutagenesi, Teratogenesi, Tossicologici, da Irritanti, da Caustici. - Effetti diretti e indiretti dell’inquinamento. - Costi dell’inquinamento. - L’inquinatore. - Razionale dell’inquinamento. - Tecniche di riduzione dell’inquinamento. - Costi del disinquinamento. L’inquinamento dell’aria Classificazione generale. - Classificazione delle composizioni aria-inquinante: gas e vapori; esalazioni; fumi; polveri; mist o nebbia artificiale; smog. - Influenze meteorologiche. - Inquinanti primari e secondari. - Gli inquinanti della combustione. - Indici di qualità dell’aria. - L’effetto serra. - L’effetto frigorifero. - L’effetto UV. - Le piogge acide. L’Inquinamento dell’acqua Modalità di inquinamento. - Standard di qualità delle acque. - Standard di pericolosità: gruppi I e II. - Tipologia degli inquinanti chimici: Biodegradabili e Non Bioreagenti. - Indici di carico organico. - Indici di qualità. - Fenomeni di autodepurazione: Rimozione e Trasformazione. - Acque sotterranee: Formazione e turnover; Tipologie, meccanismi e indicatori di inquinamento. - Eutrofizzazione delle acque superficiali: Indici biologici, chimici e fisici. - Acque reflue: Derivazione, Smaltimento naturale L’Inquinamento del suolo Tessitura del suolo. - Fenomeni di autodepurazione. - I pesticidi. - I fertilizzanti. - I rifiuti: Classificazione. - Le discariche controllate - L'incenerimento. - Il compostaggio. Determinazioni di sostanze inquinanti Ione ammonio. - Ione nitoso. - Ione nitrato. - Diossido di zolfo o Anidride solforosa. - Solfuro di idrogeno o Acido solfidrico. – Mercaptani.
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MM: METODOLOGIA DIAGNOSTICA MOLECOLARE
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- Organizzazione del laboratorio di biologia molecolare clinica e concetti di base - Estrazione degli acidi nucleici - Separazione elettroforetica - Tecniche di ibridazione degli acidi nucleici - Ibridazione dot/blot e reverse dot/blot - Microarrays - Reazione polimerasica a catena – PCR e Real-time PCR - Metodiche di sequenziamento del DNA - Principali metodi impiegati in proteomica (cromatografia e spettrometria) - Ibridazione in situ, FISH ed Array-CGH.

Bibliografia

Modalità d'esame

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MM: METODI E TECNICHE DI GENETICA E BIOLOGIA MOLECOLARE
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Orale
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MM: BIOTECNOLOGIE RICOMBINANTI
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Esame scritto in forma di elaborato di un protocollo sperimentale discusso durante il corso e colloquio orale.
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MM: BIOLOGIA MOLECOLARE
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Esame orale
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MM: BIOCHIMICA E CHIMICA DELL'INQUINAMENTO AMBIENTALE
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Prova orale, in contemporanea con gli altri docenti del corso
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MM: METODOLOGIA DIAGNOSTICA MOLECOLARE
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L’esame finale si svolge mediante prova scritta.