Codice insegnamento

4S003254

Crediti

12

Coordinatore

Antonella Furini

Lingua di erogazione

Italiano

Settore Scientifico Disciplinare (SSD)

AGR/07 - GENETICA AGRARIA

Moodle Seminari 0

L'insegnamento è organizzato come segue:

Obiettivi formativi

L’obiettivo del modulo di Metodologie di Genetica del corso di Metodologie di Genetica e Microbiologia è di fornire agli studenti le conoscenze sulle tecnologie del DNA ricombinante e le metodologie applicate alle analisi genetiche molecolari e genomiche. Con le lezioni frontali si fornirà una panoramica delle metodologie genetiche tradizionali e di quelle più innovative per l’analisi dei geni e della loro funzione. I concetti acquisiti consentiranno l'applicazione delle tecnologie molecolari di base utilizzate per gli studi genetici e la comprensione delle metodologie più innovative. Complessivamente queste conoscenze consentiranno agli studenti di seguire e comprendere le parti sperimentali dei lavori scientifici in ambito genetico molecolare e di applicarle agli esperimenti di laboratorio.

Il modulo di Metodologie di Microbiologia si propone di fornire agli studenti gli strumenti di conoscenza nel settore microbiologico e biotecnologico che consenta loro di affrontare i corsi di livello superiore dell’area biotecnologica; in particolare aiuta a comprendere le potenzialità applicative dei microrganismi in campo agro-alimentare e le interazioni tra microrganismi, alimento, tratto intestinale e salute.

Programma

Il programma del modulo di Metodologie di Genetica include i seguenti argomenti:
Teoria:
- Descrizione di colture cellulari animali e vegetali;
- Trasformazione genetica di piante e cellule animali;
- Metodi di trasformazione di cellule batteriche;
- Vettori e marcatori di selezione, tecniche di clonaggio tradizionali e tecnologia GATEWAY e TOPOCLONING;
- Estrazione di DNA plasmidico e genomico.
- Selezione di colonie ricombinanti;
- Utilizzo di geni reporter (GFP, YFP) per la localizzazione cellulare.
- Preparazione e transfezione di protoplasti (Prof. Furini)
- Estrazione del DNA genomico;
- Analisi dei genomi tramite Southern blotting;
- Marcatori molecolari basati su ibridazione e su PCR ed analisi di linkage;
- Approcci alternativi per il mappaggio di geni e l'analisi dei genomi;
- Sequenziamento classico Sanger e cenni su sequenziamento NGS;
- Tecniche di mutagenesi random e sito specifica e cenni di genome editing;
- Applicazioni della mutagenesi nella genetica diretta e genetica inversa per comprendere la funzione dei geni;
- Estrazione di RNA e analisi dell’espressione genica tramite Northern blotting, RT-PCR e Real Time RT-PCR (Prof. Bellin)

Laboratorio
1.Clonaggio di un gene con l’inserimento nel vettore di un signal peptide.
Strategia di clonaggio, disegno dei primers, allestimento PCR.
Purificazione della banda di PCR, digestione con enzimi di restrizione di prodotto di PCR e plasmide, corsa elettroforetica ed excisione delle bande da gel.
Eluizione delle bande, corsa elettroforetica per quantificare il DNA plasmidico ed il prodotto di PCR. Defosforilazione del vettore. Ligazione. Preparazione di piastre di LB con antibiotico, XGAL, IPTG. Trasformazione di cellule competenti. Purificazione del DNA batterico e verifica del clonaggio
2. Trasformazione genetica di tabacco
Tabacco mantenuto in condizioni di sterilità in vitro, preparazione degli espianti e co-coltivazione con agrobatterio. Analisi del vettore utilizzato per la trasformazione. Coltivazione degli espianti putativamente trasformati su terreno selettivo. Analisi delle piante transgeniche con un saggio enzimatico (saggio istochimico di attività β-glucuronidasica), analisi molecolare per PCR su DNA genomico.
3. Transfezione di protoplasti per analisi della localizzazione subcellulare
Tabacco mantenuto in condizioni di sterilità in vitro. Digestione enzimatica della parete cellulare per il rilascio dei protoplasti. Transfezione con differenti vettori e visualizzazione al microscopio a fluorescenza della proteina in diversi compartimenti cellulari (reticolo endoplasmatico, membrana cellulare, vacuolo). (Prof. Furini)
4. Mapping della posizione genomica di un gene responsabile di un fenotipo di interesse usando una pproccio basato su analisi di mutanti
Estrazione del DNA genomico dall’organismo modello Arabidopsis thaliana utilizzando due diverse metodologie di estrazione. Confronto dell’efficienza di estrazione e qualità del DNA prodotto mediante analisi spettrofotometrica e caricamento in gel di agarosio. Ottimizzazione di marcatori molecolari SSLP sui parentali di una popolazione segregante F2 ottenuta mediante outcrossing di mutante con fenotipo alterato. Estrazione del DNA genomico da individui della progenie ed analisi di segregazione dei marcatori SSLP sugli individui della progenie e scoring su gel. Analisi dell’associazione genetica tra i marcatori analizzati e determinazione della posizione genomica della mutazione e quindi del gene responsabili del fenotipo di interesse.
5. Mutagenesi sito-specifica per sostituire un aminoacido putativamente coinvolto nell’attività enzimatica di una proteina
Analisi della sequenza e determinazione del sito di interesse da mutagenizzare, disegno dei primers specifici per la mutagenesi. Amplificazione con i primer disegnati e reazione di fosforilazione, ligazione e digestione con DpnI per l’arricchimento del plasmide mutagenizzato. Trasformazione di cellule competenti. Recupero delle colonie trasformate e miniprep. Screening dei mutanti mediante amplificazione ed analisi di restrizione. Analisi della sequenza del plasmide selezionato per confermare la mutagenesi e discussione su possibili applicazioni.
6. Analisi di espressione del transgene in un organismo transgenico mediante real-time RT-PCR:
Estrazione dell’RNA dall’organismo transgenico e dal wt. Valutazione della qualità e quantità dell’RNA estratto, trattamento con DNAsi, retrotrascrizione e reazione real-time RT-PCR. Valutazione dei diversi livelli di espressione del transgene nel controllo e nell’organismo transgenico mediante calcolo del deltadeltaCt (Prof. Bellin)

Il programma del modulo di Metodologie di Microbiologia include i seguenti argomenti:
Teoria
- Il rischio nel laboratorio di microbiologia. Classificazione e pericolosità degli agenti biologici. Microrganismi geneticamente modificati (MOGM). Classi di impiego dei MOGM. Norme di biosicurezza.
- Il microbiota del tratto gastro-intestinale dell’uomo. Fattori che influenzano la composizione del microbiota (età, antibiotici, dieta, malattie). Probiotici e prebiotici.
- L’antibiotico-resistenza (AR) nei batteri alimentari: possibili rischi per i consumatori. Il concetto QPS. Meccanismi di AR. Trasferimento di geni di AR. Nuovi approcci per lo studio dell’AR.
- I microrganismi e gli alimenti: il vino. Il ruolo dei lieviti e dei batteri. Fermentazioni spontanee e guidate. Selezione di colture starter. Nuove prospettive nella ricerca microbiologica.

Laboratorio
Sono previsti 2 CFU di esercitazioni durante i quali saranno applicati approcci tradizionali e biomolecolari per :
- lo studio di colture batteriche impiegate nella produzione di alimenti funzionali (es latti fermentati probiotici),
- la ricerca e caratterizzazione di batteri commensali con antibiotico-resistenze in prodotti con microbiota complesso,
- la valutazione dell’effetto di vari lieviti, incluso un ceppo di Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificato, sulla cinetica fermentativa e la produzione di metaboliti di interesse per la qualità del vino in prove di microvinificazione.

Modalità d'esame

Alla fine del corso, per il modulo di Metodologie di Genetica gli studenti devono consegnare la relazioni inerenti le esperienze di laboratorio. L’accertamento dell’apprendimento si effettua mediate prova scritta relativa a quanto illustrato durante il corso nelle lezioni frontali e di laboratorio. L'obiettivo della prova di accertamento è di verificare l'apprendimento da parte dello studente degli argomenti illustrati nel corso sia nella parte teorica che pratica. Si compone di quesiti aperti e test a crocette ed esercizi relativi alla parte di laboratorio.
Complessivamente la prova consta di due parti da affrontare contestualmente per un totale di 90 punti (40 punti parte del programma svolto dalla Prof.ssa Furini e 50 punti per la parte svolta dalla Prof.ssa Bellin). Il punteggio viene convertito in trentesimi.

Per il modulo di Metodologie di Microbiologia al termine delle lezioni è prevista la consegna di una relazione relativa alle esercitazioni pratiche; a questa relazione sarà associato un punteggio massimo di due punti. La verifica dell’apprendimento avviene attraverso una prova scritta. La prova scritta conterrà sei quesiti a ciascuno dei quali viene associato un valore massimo di 5 punti e mira a verificare le abilità e le conoscenze acquisite nell’ambito delle tematiche affrontate durante le lezioni frontali e le attività di laboratorio. Per superare la prova è necessario che il candidato raggiunga almeno 18 punti.

Per gli studenti che hanno superato l'esame di entrambi i moduli il voto finale è la media ponderata dei due voti.