Codice insegnamento

4S008292

Docente

Salvatore Fusco

Coordinatore

Salvatore Fusco

Crediti

6

Lingua di erogazione

Italiano

Settore Scientifico Disciplinare (SSD)

BIO/10 - BIOCHIMICA

Periodo

Secondo semestre dal 7 mar 2022 al 10 giu 2022.

Orario Lezioni Moodle Seminari 0

Obiettivi formativi

Il corso si propone di fornire allo studente le conoscenze di base e avanzate della biocatalisi applicata in ambito industriale, terapeutico e diagnostico. In particolare, gli obiettivi principali del corso riguardano la comprensione: 1) dei principi alla base della catalisi enzimatica; 2) delle nuove frontiere applicative degli enzimi; 3) delle metodiche molecolari per ottimizzare la reattività degli enzimi e 4) degli approcci innovativi per lo sviluppo di enzimi artificiali che mostrano reattività non naturali.

Programma

Il programma dettagliato del corso è attualmente in via di definizione. Gli argomenti di seguito riportati sono solo indicativi dei contenuti didattici del corso e possono essere soggetti a modifiche da parte del docente:

1. Introduzione e contesto: Vantaggi dei catalizzatori biologici; Catalisi enzimatica; Principi di cinetica delle reazioni enzimatiche; Equazione di Michaelis e Menten; Significato e interpretazione delle costanti cinetiche; Come studiare l'attività enzimatica e determinare le costanti cinetiche; Aspetti pratici dei saggi enzimatici per la determinazione delle costanti cinetiche; Influenza del "dead time"; Metodi per la determinazione dell’attività enzimatica; Saggi continui e discontinui.

Ingegneria proteica per l’ottimizzazione dell’attività enzimatica

2. Modificazioni chimiche: Principi e definizioni; Modificatori chimici e inibitori irreversibili; Marcatori di affinità, substrati suicidi e analoghi dello stato di transizione; Modifiche chimiche non specifiche: casi studio (EDCA, NHS, anidridi acide); Modifiche chimiche specifiche: Atom Replacement and Segment Reassembly; Modificatori della specificità delle protesi a serina e delle nucleasi; Legame covalente di cofattori.

3. Rational Design: Introduzione ai vari metodi di modifica sito-diretta; Sequence Overlap Extension (SOE) or Fusion PCR; -Combined Chain Reaction (CCR); MegaPrimer PCR amplification (case studies); Whole plasmid PCR; Cassette mutagenesis (Gibson assembly); The Kunkel method; Megaprimer whole-plasmid PCR; QuikChange mutagenesis; Site-directed mutagenesis by recombineering; Single Oligonucleotide Mutagenesis and Cloning Approach (SOMA); UnRestricted Mutagenesis and Cloning (URMAC); LFEAP mutagenesis (case studies); Site-saturation mutagenesis: concetti ed applicazioni.

4. Directed Evolution: Rational Design versus Directed Evolution; The Paradigm Shift; Evolution and Probability; Randomly Mutated Plasmid Libraries Using Mutator Strains; Error-Prone PCR (The Bias Problem, Some Considerations and Case Studies); SeSaM Method; RID Mutagenesis; MAX randomization; MEGAWHOP; Gene Assembly Mutagenesis; Random Oligonucleotide Mutagenesis; Recombination methods: DNA Shuffling, Family Shuffling with Single-Stranded DNA, DNA Recombination by Random Priming (RPR), StEP, RDA-PCR, RACHITT, ITCHY, SHIPREC; Laboratory neutral drift.

5. Selection and Screening: The Importance of the Right Screening System; Enzimi specialisti e generalisti; Screening vs Selection; In vivo and In vitro Selection Systems: phage diplay; Screening: Agar Plate, Microtiter Plate (Pooling), Cells in Droplets, Cells as Micro-Reactors, Cell Surface Display and in vitro compartmentalization.

6. Semi-Rational Design: Selection of the Preferred Experimental Approach; Identification of Functional Sites by Evolutionary Tracing; SCOPE; CAST, Method and Iterative CASTing; ISM Method; SCHEMA; Development of enzymes for industrial applications.

7. Protein Engineering for Enzyme Optimization: Case Studies; CoFi Blot and Hot-CoFi; Sequence-based engineering: MSA, CA and ASR; Structure-based engineering: Beta-factor analysis, MDS, FoldX and Rosetta_ddg;
8. Statistical learning and deep artificial neural networks_selected applications in proteomics

9. Enzymes in non-conventional media: Principi della chimica verde; Uso degli enzimi nella sintesi organica (SWOT analysis); Principi di "medium engineering"; Vantaggi e svantaggi dell'utilizzo di solventi organici nella biocatalisi; L'importanza dell'acqua nell'applicazione dei mezzi non convenzionali per la biocatalisi; Memoria molecolare: come preparare gli enzimi per reazioni in solventi organici. Uso degli enzimi in solventi organici, liquidi ionici e fluidi supercritici.

10. Catalisi enzimatica omogenea ed eterogena (immobilizzazione):

Catalisi enzimatica omogenea: Aree di applicazione della catalisi omogenea; Sistemi multienzimatici (cascate enzimatiche lineari, parallele, ortogonali e cicliche); Esempi pratici di cascate enzimatiche (produzione di composti chimici profumati, amminoacidi non naturali, precursori plastici, pirrolidina di-sostituite, derivati della D-fenilalanina);

Catalisi eterogena (immobilizzazione degli enzimi); Vantaggi e svantaggi dell’immobilizzazione; Supporti per l’immobilizzazione; Strategie d’immobilizzazione (covalente, adsorbimento, intrappolamento e incapsulamento); Immobilizzazione senza supporto (CLECs and CLEAs); Nuove frontiere dell’immobilizzazione enzimatica: supporti virali e nanoreattori.

11. Il sistema CRISPR-Cas principi e applicazioni: CRISPR locus e geni cas; Meccanismo di funzionamento del sistema CRISPR-Cas; I tre tipi principali di sistemi CRISPR/Cas; Approfondimenti sul sistema CRISPR/Cas9; Applicazione del sistema CRISPR/Cas9 per il genome editing e l’ingegneria proteica; Varianti dell’endonucleasi Cas9 e loro applicazioni; il sistema CRISPR/Cas9 come strumento di screening di library di mutanti generate mediante directed evolution.

12. Biocatalisi applicata alle plastiche: Proprietà chimico-fisiche che influenzano la degradabilità delle plastiche; Enzimi che idrolizzano polimeri plastici (PET hydrolytic enzymes (PHEs)); Ingegneria proteinica per l’ottimizzare dei PHEs; Ideonella sakaiensis quale modello di batterio che metabolizza la plastica PET; Enzimi specifici per l’idrolisi del PET (PETasi);

Materiale didattico:
-Diapositive del corso (fornite al termine di ogni lezione)
-Articoli scientifici (referenze citate durante le lezioni)

Bibliografia

Modalità d'esame

L'esame finale mira a verificare il raggiungimento degli "Obiettivi formativi" relativi agli argomenti riportati nel "Programma dell’insegnamento".
La modalità di verifica dell’apprendimento prevede una prova orale volta ad accertare sia l’acquisizione delle conoscenze definite nel programma d'insegnamento sia la capacità di eseguire i necessari collegamenti logico-deduttivi. In particolare, il grado di completezza della risposta, il livello di integrazione tra i vari contenuti del corso e l'appropriatezza scientifica del linguaggio saranno tutti elementi oggetto di valutazione.
Inoltre, il raggiungimento da parte del/della candidato/a di una visione organica dei temi affrontati a lezione, congiunta alla loro utilizzazione critica, la capacità di fare collegamenti, la dimostrazione del possesso di una padronanza espositiva e di linguaggio specifico saranno valutati con voti di eccellenza.
La modalità d'esame è la stessa sia per i candidati frequentanti sia non frequentanti.