L'insegnamento è organizzato come segue:

Obiettivi formativi

Il corso è articolato in 5 moduli di laboratorio interdisciplinari centrato su un argomento di rilevanza biologica. Lo scopo principale del corso è quello di offrire allo studente strumenti per focalizzare il problema sfruttando diverse tecniche altamente complementari. Il modulo di GENETICA ha lo scopo di fornire competenze sugli approcci sperimentali e le analisi bioinformatiche necessarie all’identificazione di varianti genetiche associate a specifiche condizioni patologiche e la loro validazione. Il modulo di INGEGNERIA PROTEICA ha lo scopo di fornire allo studente informazioni specifiche sui principi e le tecniche utilizzate nell'ambito dell'ingegneria proteica, con particolare riferimento alla produzione di proteine ricombinanti in sistemi eterologhi. Il modulo di BIOINFORMATICA ha lo scopo di introdurre i metodi computazionali utilizzati oggi per la predizione dell'effetto di varianti associate a malattie sulla struttura/funzione delle proteine. Al termine dell’insegnamento lo studente dovrà dimostrare di essere in grado di utilizzare i metodi computazionali allo stato dell'arte per la predizione dell'effetto dei mutanti a partire della sequenza e della struttura delle proteine. Il modulo di PROTEOMICA DI ESPRESSIONE DIFFERENZIALE si prefigge l’obiettivo di far acquisire manualità di laboratorio per l’allestimento di un esperimento di proteomica differenziale. L’esperimento potrà essere mirato al confronto di un campione patologico con un campione controllo per l’identificazione di potenziali biomarcatori di utilità clinica; oppure mirato al confronto di un campione cellullare trattato o non con un farmaco per il riconoscimento del meccanismo d’azione molecolare del farmaco stesso. Il modulo di GENETICA TRASLAZIONALE ha l’obiettivo di far acquisire agli studenti le metodologie embriologiche e molecolari utilizzate per studiare in embrioni di Zebrafish (Danio rerio) l’effetto di specifiche alterazioni genetiche associate a patologie umane.

Programma

L’obiettivo del modulo di genetica è l’identificazione di varianti geniche a singolo nucleotide associate o causative di specifiche condizioni patologiche. Il corso permetterà di acquisire le seguenti competenze: come identificare i geni associati alla patologia oggetto di studio, come selezione l’approccio sperimentale per catturare i geni di interesse, come svolgere le fasi sperimentali per la produzione dei dati di sequenziamento e la loro analisi bioinformatica, e come validare i marker identificati.
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Il modulo di Bionformatica si svolgerà interamente in un laboratorio didattico computerizzato. Durante il corso si farà riferimento all'articolo: Predicting the Effects of Amino Acid Substitutions on Protein Function scritto da Pauline C. Ng and Steven Henikoff e pubblicato sul giornale: Annual Review of Genomics and Human Genetics. Le tecniche presentate nell'articolo saranno brevemente introdotte a lezione, per dopo utilizzare i metodi per analizzare l'effetto di mutanti sulla Calmodulina umana. Metodi da utilizzare: Sequence based methods: - Sift - PolyPhen - Panther - PSEC Strcture based methods - Analisi della struttura proteica utilizzando il programma Pymol - Introdurre il mutante nella proteina wild-type - analisi delle interazioni perdute/guadagnate rispetto al wild-type - Studio del potenziale elettrostatico sulla superficie della proteina (wld-type e mutata) Annotation based methods: Pfam

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Modulo di ingegneria proteica: Definizione di proteina ricombinante. Produzione di proteine ricombinanti (clonaggio, espressione, purificazione). Introduzione all’ingegneria proteica. Progettazione di un esperimento di base di ingegneria proteica. Esempi specifici di proteine ingegnerizzate e loro studio (mutagenesi sito specifica, Gel elettroforesi, fluorescenza basata sull’utilizzo di sonde)

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Il modulo PROTEOMICA DI ESPRESSIONE DIFFERENZIALE di espressione comprenderà esperienze pratiche fondamentali per un laboratorio di proteomica, ad esempio la quantificazione di un estratto proteico per l’analisi proteomica, la separazione delle proteine tramite mappe elettroforetiche bidimensionali, la rivelazione del profilo proteomico con diversi metodi di colorazione (colorimetrico e fluorescente), l’acquisizione dei profili proteomici, ed un’introduzione all’identificazione delle proteine deregolate tramite spettrometria di massa.

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Il modulo di genetica funzionale permetterà allo studente di avere una panoramica della tecnica più aggiornata per studiare in-vivo le alterazioni associate a mutazioni patogene. Le esperienze pratiche si concentreranno sull'analisi dei mutanti di Zebrafish (Danio rerio) generati con la metodologia CRISPR/cas9. Da un punto di vista pratico, gli studenti applicheranno tecnica diverse come l’ibridazione in-situ e la microscopia a campo chiaro, per rilevare alterazioni fenotipiche e funzionali negli embrioni di zebrafish con mutazioni del gene calmodulina1.

Bibliografia

Modalità d'esame

La comprensione delle esperienze pratiche e l'acquisizione dei concetti sottesi alle esperienze, sarà verificata attraverso domande aperte (2 bioinformatica, 2 ingegneria proteica; 2 proteomica di espressione; 2 genetica e 3 genetica traslazionale) in una prova scritta globale composta da un totale di 10 domande, da svolgere in un tempo di 3 ore