Codice insegnamento

4S003719

Crediti

12

Coordinatore

Alessandra Maria Bossi

Lingua di erogazione

Italiano

Moodle Seminari 0

L'insegnamento è organizzato come segue:

Obiettivi formativi

MODULO I - Obiettivi formativi: UL: Trascrittomica teoria La parte teorica del corso ha come obiettivo quello di spiegare che cosa è e a cosa può servire una analisi trascrittomica e di fornire le conoscenze relative alle diverse tecniche ed approcci che si possono applicare per l'analisi trascrittomica. Al termine del corso lo studente saprà affrontare la pianificazione di esperimenti trascrittomici e comprendere la presentazione ed interpretazione di dati trascrittomici in articoli scientifici. UL: Trascrittomica laboratorio La parte pratica del Corso ha come obiettivo quello di fornire conoscenze pratiche per una corretta pianificazione, realizzazione ed interpretazione di analisi trascrittomiche. Gli studenti avranno l'opportunità di effettuare la pianificazione sperimentale dell'analisi trascrittomica, affrontare la preparazione di campioni per l'analisi RNASeq ed effettueranno l'analisi bioinformatica ed interpretazione dei dati trascrittomici ottenuti. UL: Metabolomica teoria -definire correttamente gli approcci metabolomici “targeted” e “untargeted” -distinguere i punti critici di un disegno sperimentale; -organizzare un piano di estrazione e analisi del metaboloma adeguato al/ai metabolita/i bersaglio; -descrivere gli elementi chiave necessari per il processamento dei dati crudi e la produzione delle FQM (“Feature Quantification Matrix”); -utilizzare metodi di analisi statistica dei dati adeguati al problema sperimentale; -applicare l’analisi metabolomica allo studio della complessità biologica di cellule/tessuti/organi/organismi, dal punto di vista delle piccole molecole, quali intermedi e prodotti finali del metabolismo; -utilizzare un linguaggio scientifico appropriato. MODULO II - Obiettivi formativi: UL: Metabolomica laboratorio -progettare un disegno sperimentale; -interpretare gli spettri di massa; -identificare alcuni semplici metaboliti attraverso gli alberi di frammentazione; -processare un esperimento complesso di metabolomica complesso attraverso specifici software; -analizzare un esperimento di metabolomica complesso utilizzando gli strumenti statistici appropriati; -acquisire proprietà di linguaggio nella specifica materia. UL: Proteomica teoria Il corso si prefigge di fornire le principali basi teoriche per affrontare un'analisi proteomica, attraverso un percorso che inizia fornendo conoscenze circa le caratteristiche chimico-fisiche del campione proteico e circa i relativi metodi di frazionamento, per entrare successivamente nel vivo delle metodiche di proteomica, fornendo conoscenza circa i metodi separativi impiegati in proteomica (in gel, gel free), di analisi in spettrometria di massa dei peptidi e infine di identificazione delle proteine. Il percorso vuole fornire abilità teorico-strategiche di proteomica, distinte in conoscenza del materiale proteico e del campione in analisi, padronanza dei metodi per estrarre proteine dal campione, abilità decisionali nella scelta del metodo separativo; abilità di base di analisi in spettrometria di massa e di lettura degli spettri; abilità di ricerca sulle banche dati in silico per l’identificazione delle proteine, abilità di validazione del risultato; abilità di definizione di una strategia quantitativa di analisi proteomica. Il percorso formativo ha l’obiettivo di fornire tutte quelle conoscenze necessarie a maturare l’abilità di applicare l’indagine proteomica a problematiche di tipo agro-industriali, tra le quali la adulterazione di alimenti, la provenienza e tracciabilità di materie prime. UL: Proteomica laboratorio Il laboratorio è un momento formativo pratico. Ha la finalità di avvicinare lo studente alla pratica di laboratorio proteomico, traducendo la teoria in fasi sperimentali. Sono fornite le basi pratiche dell'analisi proteomica, affrontando sperimentalmente le fasi di disegno sperimentale, trattamento del campione, metodi separativi in gel, analisi del risultato in silico. Il laboratorio è improntato a sviluppare abilità sperimentali di proteomica. Il tipo di problematica selezionata per il percorso di laboratorio è inerente la tracciabilità del prodotto alimentare.

Programma

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MM: MODULO II
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------------------------ MM: Metabolomica laboratorio ------------------------ -Simulazione di disegno sperimentale su un problema reale attraverso l’utilizzo della trascrittomica e metabolomica: agli studenti, organizzati in gruppi, verrà assegnato un problema sperimentale, risorse virtuali (risorse biologiche, “facilities”, laboratori attrezzati ed un budget) e verrà loro chiesto di stendere un piano sperimentale; -estrazione di metaboliti vegetali a media e bassa polarità, pulizia dei campioni attraverso Estrazione in fase solida (SPE), visita all’attrezzatura LC-MS; - metabolomica “untargeted” basata su LC-MS: riconoscimento degli ioni molecolari, alberi di frammentazione e identificazione dei metaboliti attraverso il loro valore di M/Z e la loro frammentazione; -processamento dei cromatogrammi e costruzione della matrice di dati; analisi univariata e multivariata dei dati. ------------------------ MM: Proteomica laboratorio ------------------------ La preparazione del campione. Separazione in gel. Analisi di proteine/peptidi tramite spettrometria di massa e massa/massa. Analisi degli spettri di massa e ricerca in Banche Dati per l’identificazione delle proteine. ------------------------ MM: Proteomica teoria ------------------------ Lo studio della proteomica implica conoscenze di base del materiale proteico, forniti con i corsi di biochimica di base, e nozioni di base di metodi biochimici, forniti con insegnamenti di biochimica analitica di base. Gli argomenti trattati durante il modulo di proteomica sono: • Il concetto di proteoma. • La preparazione del campione. • Metodiche Gel-Based. • Metodiche Gel-Free. • Il pre-frazionamento per l’analisi di proteine poco abbondanti. • Analisi di proteine/peptidi tramite spettrometria di massa e massa/massa. • Analisi degli spettri di massa e ricerca in Banche Dati per l’identificazione delle proteine. • Cenni di proteomica quantitativa. • Applicazioni in ambito agro-alimentare dell’analisi proteomica. Le lezioni teoriche (3 CFU) sono affrontate in aula. Ad esse è affiancata una parte di esercitazioni di laboratorio (1CFU), svolte in piccoli gruppi (3-4 persone), per tradurre in pratica i concetti teorici, affrontando il problema dell’analisi proteomica di un campione di origine agroalimentare. Le esercitazioni si suddividono in 4 incontri in cui si trattano praticamente i seguenti argomenti: • Definizione di un protocollo di trattamento del campione; trattamento del campione. • Separazione del campione proteico con approcio in gel, prima dimensione. • Separazione del campione proteico con approccio in gel, seconda dimensione. • Analisi del risultato. Identificazione delle proteine tramite impiego di banche dati proteiche.
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MM: MODULO I
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------------------------ MM: Metabolomica teoria ------------------------ -il disegno sperimentale; -l’estrazione dei metaboliti e la preparazione dei campioni per la metabolomica basata su LC-MS; -formati e conversione dei dati in metabolomica; -l’analisi dei cromatogrammi e l’annotazione dei metaboliti; -il pre-processamento dei dati e l’effetto di varie tecniche di normalizzazione; -il processamento dei dati (tramite MZmine); estrazione delle “M/Z” features; la deconvoluzione dei cromatogrammi e l’allineamento dei dati; produzione della “Feature Quantification Matrix”; -analisi dei dati attraverso tecniche multivariate (PCA, PLS-DA, OPLS-DA) ed univariate. ------------------------ MM: Trascrittomica laboratorio ------------------------ Pianificazione di disegni sperimentali per analisi trascrittomiche Campionamento ed estrazione dell’RNA da campioni. Valutazione della qualità dell’RNA estratto tramite Bioanalyser microchip (Agilent) Preparazione di una libreria per analisi RNASeq con il protocollo TruSeq Illumina. Il protocollo include i seguenti passaggi: purificazione dell’mRNA, frammentazione, sintesi di cDNA con random primers, sintesi del secondo filamento, purificazione del cDNA, riparazione delle porzioni terminali del cDNA, purificazione del cDNA, adenilazione all’estremità 3’ terminale del cDNA per la ligazione degli adattatori per ottenere le librerie da sequenziare, ligazione degli adattatori contenenti gli index specifici per le diverse librerie da sequenziare, purificazione del cDNA ligato agli adattatori, arricchimento mediante PCR, purificazione delle librerie. Valutazione della qualità della libreria prodotta pre-sequenziamento Analisi bioinformatica delle reads prodotte mediante sequenziamento delle librerie ed identificazione di geni differenzialmente espressi in seguito al trattamento (FASTQC, Trimming delle sequence, allineamento delle sequenze ed identificazione statistica di geni differenzialmente espressi, esercizi con dataset ridotti) Confronto con dataset ottenuti da analisi microarray Esempi di analisi per l’interpretazione di dati trascrittomici (data mining) su geni differenzialmente espressi (diagrammi di Venn, gene ontology, analisi di arricchimento, clustering) ------------------------ MM: Trascrittomica teoria ------------------------ Il trascrittoma: composizione e controllo. Obiettivi dello studio del trascrittoma Metodi di estrazione dell’RNA, valutazione della qualità dell’RNA e retrotrascrizione: considerazioni specifiche per l’analisi trascrittomica; richiami a metodiche per l’analisi di espressione di singoli geni Analisi trascrittomiche: significato, introduzione delle tecniche e disegno sperimentale Metodi per l’analisi trascrittomica basati su PCR e visualizzazione di profili (Differential display, cDNA AFLP) Metodi per l’analisi trascrittomica basati sull’ibridazione (macroarray, microarray, produzione di microarray, piattaforme per la produzione di oligo microarray, design di microarray, controlli per l’analsi microarray, protocolli per la preparazione e marcatura delle probe, protocolli di ibridazione, acquisizione di immagini macroarray, procedura per l’analisi dei dati microarray, data mining) Metodi per l’analisi trascrittomica basati sul sequenziamento (librerie EST, SAGE, MPSS, RNA Seq, procedura per la preparazione di librerie per RNASeq, valutazione della qualità di librerie RNASeq, sequenziamento di librerie RNASeq, procedure per l’analisi di dati RNASeq, data mining) ed esempi di applicazioni specifiche.

Modalità d'esame

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MM: MODULO II
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------------------------ MM: Metabolomica laboratorio ------------------------ Dopo presentazione del lavoro di ciascun gruppo davanti a tutti gli studenti del corso e sua discussione critica, ciascuno studente riceverà un voto (da 0 a2) che contribuirà, addizionato al voto del colloquio orale, al voto finale parziale dei moduli di metabolomica. ------------------------ MM: Proteomica laboratorio ------------------------ L’esame è volto ad accertare l’acquisizione da parte dello studente delle abilità descritte negli obiettivi (conoscenza del materiale proteico e del campione in analisi, padronanza dei metodi per estrarre proteine dal campione, abilità decisionali nella scelta del metodo separativo; abilità di base di analisi in spettrometria di massa e di lettura degli spettri; abilità di ricerca sulle banche dati in silico per l’identificazione delle proteine, abilità di validazione del risultato; abilità di definizione di una strategia quantitativa di analisi proteomica). La prova di esame è scritta, con domande aperte, dura 2 ore. La prova scritta si integra, a richiesta, con una prova orale. La prova di esame sarà valutata sulla base della capacità dello studente di rispondere alle domande correlando concetti e metodi in modo appropriato e, laddove proposte, dettagliando il significato di equazioni, o riportando grafici pertinenti. ------------------------ MM: Proteomica teoria ------------------------ L’esame è volto ad accertare l’acquisizione da parte dello studente delle abilità descritte negli obiettivi (conoscenza del materiale proteico e del campione in analisi, padronanza dei metodi per estrarre proteine dal campione, abilità decisionali nella scelta del metodo separativo; abilità di base di analisi in spettrometria di massa e di lettura degli spettri; abilità di ricerca sulle banche dati in silico per l’identificazione delle proteine, abilità di validazione del risultato; abilità di definizione di una strategia quantitativa di analisi proteomica). La prova di esame è scritta, con domande aperte e dura 2 ore. La prova scritta si integra, a richiesta, con una prova orale. La prova di esame sarà valutata sulla base della capacità dello studente di rispondere alle domande correlando concetti e metodi in modo appropriato e, laddove proposte, dettagliando il significato di equazioni, o riportando grafici pertinenti.
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MM: MODULO I
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------------------------ MM: Metabolomica teoria ------------------------ L’accertamento dei risultati di apprendimento prevede una prova orale, durante la quale verrà accertato: -il grado di conoscenza in genere della materia sviluppata nel corso di studio; - la proprietà di linguaggio relativa alla materia in oggetto. ------------------------ MM: Trascrittomica laboratorio ------------------------ L'esame consiste in un colloquio orale che avrà lo scopo di accertare le conoscenze dello studente riguardo agli argomenti trattati durante le lezioni ed i laboratori. Un terzo del colloquio sarà riservato alla verifica delle conoscenze relativamente agli argomenti trattati durante la parte del laboratorio. Si discuterà la pianificazione o esecuzione di una specifica analisi trascrittomica o l'applicazione di analisi trattate nell'ambito dei laboratori. L'esame sarà uguale per studenti frequentanti e non frequentanti. ------------------------ MM: Trascrittomica teoria ------------------------ L'esame consiste in un colloquio orale che avrà lo scopo di accertare le conoscenze dello studente riguardo agli argomenti trattati durante le lezioni ed i laboratori. Due terzi del colloquio saranno riservati alla verifica delle conoscenze relativamente agli argomenti trattati durante la parte di teoria. L'esame sarà uguale per studenti frequentanti e non frequentanti.